3.3. 功能分析

用DAVID6.8 (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)对动态网络生物标志物做KEGG富集分析，前列腺癌和肝癌的动态网络生物标志物中的基因与癌症发展机制密切相关(表1，只列出部分)。基于前列腺癌数据，KEGG富集分析结果表明动态网络生物标志物与疾病的发展变化密切相关，如癌症通路、癌症转录失调、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、Wnt信号通路等，其中大多与细胞生长、分化、增殖、凋亡，调节转录和翻译有关，Wnt信号通路异常可以导致前列腺癌。肝癌的动态网络生物标志物中的基因与代谢通路、MAPK信号通路、癌症通路、癌症转录失调等。MAPK和PI3-K/Akt通路与细胞增殖和凋亡有关，并且MAPK信号通路，ErbB信号，Wnt信号通路等通路已被证实与多种癌症的发病机理相关。KEGG富集分析表明利用动态网络生物标志物得到的结果是符合系统生物学的。

3.4. 生存分析

用SurvExpress (http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp)对由基于多样本动态网络标志物法得到的生物标志物做生存分析，可知当生物体内ANXA6, CEP70, CCNA2, C-MYC, E2F-2, FES, HOXB6, IFITM1, NCOR1, POLD1, RAB11FIP1, TP53, TRAK1, UBXN11这14个基因表达异常时，前列腺癌患者存活率下降，生存时间变短(图3，请详见附录图A1)；当AKAP8, COL15A1, ENO2, FUNDC2, HMGCS2, HOMER1, IHH, JUN, NDUFA1, PAM, RRAS2, TMEM106C, WIZ, WNT1这14个基因表达异常时，肝癌患者存活率下降，生存时间变短(图4，请详见附录图A2)。并且两个数据各自的动态网络标志物的生存分析的结果表明由基于多样本动态网络标志物法找到的生物标记物能够较好地反映各自癌症的临界突变信号。

由单样本得到的生物标志物，对每个单样本的生物标志物及所有两两间公共的生物标志物做生存分析，发现当AIM1L, ANXA6, CCNA2, C-MYC, E2F-2, ECT2, POLD1, RAD51AP1, TMEM19, TP53这10个基因表达异常时，前列腺癌患者存活率下降，存活时间变短(图5，请详见附录图A3)；当APOE, COL15A1, HMGCS2, JUN, OLIG1, RFK, UAP1L1这7个基因表达异常时，肝癌患者存活率下降，存活时间变短(图6，请详见附录图A4)。这些分析结果证实了我们得到的动态网络生物标志物和病人的生存时间存在很强的关联，即当动态网络生物标志物所含基因表达异常时，病人的预后更差。

Table 1. Enrichment analysis by KEGG

表1. KEGG富集分析

Figure 3. Survival analysis based on multi-samples of prostate cancer

图3. 基于多样本动态网络生物标志物法的前列腺癌生存分析

Figure 4. Survival analysis based on multi-samples of prostate cancer

图4. 基于多样本动态网络生物标志物法的前列腺癌生存分析

Figure 5. Survival analysis based on single-samples of prostate cancer

图5. 基于单样本动态网络生物标志物法的前列腺癌生存分析

Figure 6. survival analysis based on single-samples of liver cancer

图6. 基于单样本动态网络生物标志物法的肝癌生存分析

4 讨论

复杂疾病严重损害人类健康，我们通过检测疾病恶性突变的预警信号可以更好预防和治疗复杂疾病。虽然关键是通过检测疾病恶性突变的临界信号来采取适当的干预措施防止疾病继续恶化，但是在疾病的发展过程中，由于临界突变前系统可能没有显著变化，准确检测疾病的临界信号仍富有挑战。这也是基于传统生物标志物方法可能无法诊断疾病临界信号的原因。而动态网络生物标志物方法基于生物网络的动态性质，揭示了时序列数据在接近突变点时的临界信号，这有助于我们确定许多复杂疾病的新治疗方案的有效时间窗。

基于前列腺癌数据，利用动态网络生物标志物和生存分析等方法我们一共找到了18个基因(AIM1L, ANXA6, CEP70, CCNA2, C-MYC, E2F-2, ECT2, FES, HOXB6, IFITM1, NCOR1, POLD1, RAB11FIP1, TP53, TRAK1, UBXN11, RAD51AP1, TMEM19)，当它们表达过低或过高时，会使得患者存活率下降，生存时间变短。已有研究表明这18个基因多数与细胞增殖、分裂、凋亡等有关，当它们异常表达时可能会引起细胞癌变进而诱发癌症。如C-MYC能使细胞无限增殖，促进细胞分裂，引发细胞凋亡。C-MYC与多种肿瘤发生发展有关，关于前列腺癌的大量研究表明多达30%的癌症甚至在癌前病变阶段的C-MYC基因的拷贝数已经增加了[6] [7]，在前列腺肿瘤细胞中EGR过度表达可能激活C-MYC促进肿瘤的发展[8]。TP53是抑癌基因，在许多人类癌症中发生突变，TP53的错义突变、插入或缺失造成的失活突变非常常见，基因突变频率确实很高，尤其在前列腺细胞中[9]。NCOR1与多种人类恶性肿瘤相关，它在调节各种核受体以及染色体重塑方面发挥重要作用，与膀胱癌及前列腺癌的发生、发展、预后及治疗的敏感性密切相关，NCOR1在前列腺癌组织中的表达较癌旁组织明显升高[10]。

基于肝癌数据，利用动态网络生物标志物和生存分析等方法一共找到了18个基因(AKAP8, APOE, COL15A1, ENO2, FUNDC2, HMGCS2, HOMER1, IHH, JUN, NDUFA1, OLIG1, PAM, RFK, RRAS2, TMEM106C, UAP1L1, WIZ, WNT1)，当它们过高或过低表达时会使得患者存活率下降，生存时间变短。这18个基因已有多数被证实与癌症有关。如COL15A1的缺少与肌肉和微血管恶化有关，与癌旁组织相比，它在肿瘤中表达显著增加[11]。ENO2是一个重要的肺癌肿瘤标志物，能作为生物标志物来帮助识别乳腺癌神经内分泌分化，与人类恶性肿瘤有关[12] [13]。HMGCS2在肝脏中的表达与肝脏癌前病变和肝癌发展有关，细胞分化时HMGCS2表达增加，是C-MYC的直接靶节点，C-MYC能抑制HMGCS2转录活性[14] [15]。C-JUN通过拮抗P53的活性来抑制TNF-α诱导的细胞凋亡，进而促进肝肿瘤的发展[16]。

附录

1. 基于多样本动态网络生物标志物法

基于以上定理和结论，对于复杂生物系统的多样本数据或高维时间序列数据，利用基于多样本动态网络生物标志物法我们可以检测生物系统复杂疾病的动态网络生物标志物(